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ELISA預(yù)實(shí)驗(yàn)完整攻略

點(diǎn)擊次數(shù):53   發(fā)布時(shí)間:2024/11/27 9:49:06

ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))預(yù)實(shí)驗(yàn)是開(kāi)展正式實(shí)驗(yàn)前必不可少的環(huán)節(jié),主要用于摸索合適的實(shí)驗(yàn)條件及確定實(shí)驗(yàn)的可行性。以下是ELISA預(yù)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展過(guò)程,一起來(lái)看看吧!

 

一、預(yù)實(shí)驗(yàn)的目的

確定實(shí)驗(yàn)條件:如抗原或抗體的濃度、酶的種類(lèi)和濃度、洗滌液的濃度和pH值等,以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。

確定實(shí)驗(yàn)范圍:包括*佳反應(yīng)時(shí)間和濃度范圍,以確保在正式實(shí)驗(yàn)中獲得*佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法:確保實(shí)驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性和可靠性。

減少實(shí)驗(yàn)誤差:提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和可重復(fù)性。

 

二、預(yù)實(shí)驗(yàn)的方法

 

1.實(shí)驗(yàn)樣本的選擇:

預(yù)實(shí)驗(yàn)一般通過(guò)測(cè)定少數(shù)有代表性的樣本來(lái)確定正式實(shí)驗(yàn)方案。通常,測(cè)定的樣本會(huì)分為不同的組別,不同組別的樣本由于前期處理或刺激后,靶標(biāo)物的表達(dá)量會(huì)產(chǎn)生變化。建議從各組樣本中隨機(jī)選擇1~2例樣本。如果正式實(shí)驗(yàn)測(cè)定的樣本數(shù)量多,分配到預(yù)實(shí)驗(yàn)的試劑量有限,那么至少選擇兩例樣品,建議選用1例為理論上靶標(biāo)物含量組的樣品,另1例為理論上靶標(biāo)物含量組的樣品。

 

2.*適稀釋倍數(shù)的確定:

①將樣本梯度稀釋?zhuān)筛鶕?jù)樣本中靶標(biāo)物的濃度,選擇2倍、5倍或10倍梯度稀釋?zhuān)瑫r(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品。

②標(biāo)準(zhǔn)品的制備需按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求,試劑量充足可以選擇一條完整的標(biāo)曲,試劑量有限也可以選擇部分濃度點(diǎn)(如空白孔、濃度孔、中間濃度孔以及濃度孔)。

③將測(cè)定的不同稀釋濃度的樣本測(cè)定的OD值(光密度值)與梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品OD值進(jìn)行對(duì)比,*佳稀釋倍數(shù)為此倍數(shù)稀釋后全部或絕大多數(shù)樣本OD值能夠位于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中間濃度孔對(duì)應(yīng)的OD值,即標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的*佳擬合區(qū)域。

④在做預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí),一定要設(shè)置標(biāo)曲,不設(shè)置標(biāo)曲則無(wú)法通過(guò)比較確定*適稀釋倍數(shù)。

 

3.抗原包被濃度的設(shè)定:

①將抗原溶液分別按照1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml的濃度稀釋在抗原包被液中。

②以等量隨機(jī)選取的特異性抗體血清與抗原溶液反應(yīng),在37℃孵育1小時(shí)后清洗,然后加酶標(biāo)二抗,孵育30分鐘清洗,zui hou加底物顯色,反應(yīng)終止后用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的光密度值。

③繪制ROC曲線(xiàn)(受試者工作特征曲線(xiàn)),找出臨界值。

 

4.酶標(biāo)二抗稀釋比例的確定:

①取已知陽(yáng)性和陰性血清樣本,分別用ELISA稀釋液將特異性抗體稀釋成不同濃度的酶標(biāo)二抗溶液,與包被抗原孵育、清洗后加底物顯色,zui hou用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值。

②繪制ROC曲線(xiàn),找出臨界值。

 

5.顯色時(shí)間的確定:

①顯色是ELISA實(shí)驗(yàn)中zui hou一步溫育反應(yīng),固定在酶標(biāo)板上的酶催化無(wú)色底物生成有色產(chǎn)物。

②由于ELISA實(shí)驗(yàn)會(huì)受到環(huán)境差異及實(shí)驗(yàn)操作差異的影響,商業(yè)化的ELISA試劑盒通常不會(huì)推薦固定的顯色時(shí)間,而是建議實(shí)驗(yàn)操作人員根據(jù)顯色情況判斷合適的顯色反應(yīng)時(shí)間。

③加入底物后可定時(shí)觀(guān)察反應(yīng)孔的顏色變化(如每隔5分鐘觀(guān)察一次),當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3~4孔有明顯的梯度藍(lán)色,后3~4孔梯度不明顯時(shí),即可終止。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)熟悉操作的同時(shí),也能確定合適的顯色時(shí)間。

 

三、注意事項(xiàng)

①在進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí),應(yīng)嚴(yán)格按照ELISA試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,避免由于操作不當(dāng)導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)誤差。

②預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果應(yīng)認(rèn)真記錄和分析,以便為正式實(shí)驗(yàn)提供可靠的依據(jù)。

③在預(yù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,如發(fā)現(xiàn)任何異;虿环项A(yù)期的結(jié)果,應(yīng)及時(shí)查找原因并進(jìn)行調(diào)整。

 

通過(guò)以上預(yù)實(shí)驗(yàn)的設(shè)置和操作,可以對(duì)ELISA實(shí)驗(yàn)的條件進(jìn)行初步的摸索和優(yōu)化,為后續(xù)的正式實(shí)驗(yàn)提供可靠的基礎(chǔ)。同時(shí),也能及時(shí)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)中存在的問(wèn)題,進(jìn)行針對(duì)性的改進(jìn),提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。上海恒遠(yuǎn)生物專(zhuān)業(yè)提供生命科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)服務(wù),提供實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù),為廣大科研工作者大大節(jié)省了重復(fù)勞動(dòng)的時(shí)間和精力,我們有過(guò)硬的技術(shù)咨詢(xún)和完善的售后服務(wù),購(gòu)買(mǎi)ELISA試劑盒贈(zèng)送免費(fèi)代測(cè)服務(wù),在線(xiàn)一對(duì)一技術(shù)指導(dǎo),為您解決后顧之憂(yōu)。


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